Научно-практический медицинский рецензируемый журналISSN 1727-2378 (Print)         ISSN 2713-2994 (Online)
Ru
En

Состояние микробиома десневой борозды детей с бронхиальной астмой

DOI:10.31550/1727-2378-2024-23-3-42-48
Для цитирования: Вивтаненко Т.В., Попова Л.Ю., Хлопко Ю.А., Демина Р.Р. Состояние микробиома десневой борозды детей с бронхиальной астмой. Доктор.Ру. 2024;23(3):42–48. DOI: 10.31550/1727-2378-2024-23-3-42-48
17 апреля 2024

Цель исследования: сравнить микробиом здоровой десневой борозды детей с бронхиальной астмой (БА) при различном состоянии зубов.

Дизайн: открытое сравнительное клинико-лабораторное исследование.

Материалы и методы. Десневой субстрат получен у 19 детей 3–6 лет с обострением БА, проанализированы результаты секвенирования генов 16 субъединиц рибосомной рибонуклеиновой кислоты (16S рРНК) на платформе «MiSeq» («Illumina»).

Результаты. Определены 5 основных филумов в десневой борозде: Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Fusobacterium и Bacteroidetes и доминирующий род — Streptococcus. Установлена достоверно высокая относительная распространенность видов Neisseria oralis (p = 0,0073), Hemophilic massiliensis (p = 0,046), Hemophilic paraphrohaemolyticus (p = 0,05) и Lautropia mirabilis (p = 0,05) у детей с БА без кариеса. Уровень иммуноглобулина Е (IgЕ) достоверно выше у детей с астмой и кариесом в сравнении с детьми без кариеса (461,79 ± 60,58 и 276,97 ± 81,15 МЕ/мл).

Заключение. Преобладание условно-патогенных и «здоровых» бактериальных видов филума Proteobacteria в здоровой десневой борозде детей с БА может являться показателем дисбиоза ротовой полости при БА. Гиперпродуция IgЕ у детей с кариесом, возможно, обусловлена кариесогенной флорой, что требует дальнейшего изучения.

Вивтаненко Татьяна Владимировна (автор для переписки) — к. м. н., доцент кафедры детских болезней ФГБОУ ВО ОрГМУ Минздрава России. 460000, Россия, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6. eLIBRARY.RU SPIN: 4302-8724. https://orcid.org/0009-0005-0943-0896. E-mail: [email protected]

Попова Лариса Юрьевна — д. м. н., профессор, заведующая кафедрой детских болезней ФГБОУ ВО ОрГМУ Минздрава России. 460000, Россия, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6. eLIBRARY.RU SPIN: 9351-3622. https://orcid.org/0000-0001-6306-7104. E-mail: [email protected]

Хлопко Юрий Александрович — д. т. н., доцент, ведущий научный сотрудник ЦКП ФГБУН Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН. 460000, Россия, Оренбург, ул. Пионерская, д. 11. eLIBRARY.RU SPIN: 3420-2169. https://orcid.org/0000-0002-2880-3214. E-mail: [email protected]

Демина Римма Раильевна — к. м. н., доцент кафедры терапевтической стоматологии ФГБОУ ВО ОрГМУ Минздрава России. 460000, Россия, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6. https://orcid.org/0000-0002-0697-6165. E-mail: [email protected]

Вклад авторов

Все авторы внесли существенный вклад в подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Вклад каждого из авторов: Вивтаненко Т.В. — отбор, обследование пациентов, сбор клинического материала, обзор публикаций по теме статьи, написание текста рукописи для публикации; Попова Л.Ю. — разработка дизайна исследования, проверка критически важного содержания, утверждение рукописи дляпубликации; Хлопко Ю.А. — статистическая обработка данных, анализ интерпретации данных; Демина Р.Р. — стоматологическое обследование пациента, разработка дизайна исследования.

 

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии возможных конфликтов интересов.

 

Финансирование

Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

 

Этическое утверждение

Исследование проводилось при добровольном информированном согласии законных представителей пациентов и самих пациентов. Протокол исследования одобрен Этическим комитетом Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (протокол № 11-2016, 17.06.2016).

Доктор.ру

ВВЕДЕНИЕ

Ротовая полость — это уникальная экосистема с множеством различных биотопов микроорганизмов[1]. Микробиом полости рта чрезвычайно разнообразен и включает вирусы, простейшие, грибы, археи и бактерии[2]. Идентифицировано более 1000 бактериальных филотипов, большая их часть являются комменсальными[3]. Многочисленные исследования показали связь между колонизацией патогенами и астмой, особенно в раннем детстве[4–10]. Нормальный микробиом ротовой полости выполняет защитную роль, препятствуя колонизации патогенами, что существенно для поддержания здоровья человека[11]. Для изучения роли бактерий при различных заболеваниях необходимо определить весь спектр микроорганизмов. С этих позиций метод секвенирования является самым точным, поскольку обнаруживает почти все сигнатуры ДНК микроорганизмов[12].

Десневая борозда — это пространство между эмалью коронки зуба и эпителием видимой десны, которое складывается, образуя выстланную эпителием складку вокруг зуба. Борозда открывается в полость рта, а основание желоба ограничено тонким соединительный эпителием, который заканчивается в месте прикрепления к цементной поверхности корня[13]. В микробиоме здоровой десневой борозды (глубиной до 4 мм) преобладают филотип Proteobacteria, рода: Acinetobacter, Haemophilus, Moraxella и филотип Firmicutes, рода Streptococcus, Granulicatella и Gemella, которые являются симбионтами и в большинстве случаев возвращаются в пародонтальные карманы после лечения пародонтоза[14].

Ранее установлено обогащение бронхиального микробиома взрослых с астмой родами Haemophilus, Neisseria, Fusobacterium, Porphyromonas и Sphingomonodaceae[15]. Выделенные микроорганизмы Campylobacter, Capnocytophaga, Haemophilus, Porphyromonas из нижних дыхательных путей детей с астмой (вне обострения и с обострением), были связаны с воспалительными цитокинами[16]. Колонизация ротоглотки новорожденных от матерей с астмой видами S. pneumoniae, M. catarrhalis, H. influenzae приводила к увеличению количества эозинофилов в крови и уровня общего иммуноглобулина Е (IgE) у детей в возрасте 4 лет в сравнении с детьми от матерей без астмы, при этом общая распространенность астмы в возрасте 5 лет в этой группе детей составила 33%[17]. Ранее нами был исследован микробиом зубной поверхности детей с астмой, кариесом и без него и установлено, что род Veillonella (Veillonellaceae, Selenomonadales, Negativicutes) преобладал у детей с кариесом, а относительное обилие Neisseria было значительно выше у детей без кариеса с бронхиальной астмой (p < 0,05)[18]. Исследования фактического состояния микробиома при различных заболеваниях важны, т. к. именно устойчивые комбинации микроорганизмов, а не отдельные виды бактерий могут являться триггерами заболеваний[12].

Таким образом, многочисленные исследования констатируют связь между астмой и кариесом как результат персистенции патогенов ротовой полости. Астма и кариес в большинстве случаев манифестируют в детском возрасте, когда патогены колонизируют биотопы и формируется микробиом. Информация об исследованиях микробиома десневой борозды у детей с астмой нами не обнаружена. Изучение состава микробиома на всех таксономических уровнях в данной группе детей приоритетно для понимания взаимосвязи между микробными сообществами и биотопами с установлением роли микробиома в поддержании экологического баланса.


МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Образцы материала десневой борозды были получены от 19 детей с обострением астмы в возрасте 3–6 лет, при наличие информированного согласия родителей или законных представителей ребенка.

Все дети проходили обследование и лечение на базе ГАУЗ «ООКБ № 2» г. Оренбурга, Россия). Распределение по группам (табл. 1) выполнено по состоянию полости рта: в группу «А — asthma» вошли дети с астмой без кариеса зубов (n = 9; 6 мальчиков и 3 девочки; возраст 36–71 мес), группа «С — caries» — состояла из детей с астмой и кариесом (n = 10; 6 мальчиков и 4 девочки; возраст 37–68 мес). Диагноз астмы и оценка ее тяжести были основаны на критериях GINA, 2022 г.1 Все дети имели обострение средней степени тяжести, 1 ребенок — тяжелое. Только у 1 ребенка из группы с кариесом и 2 пациентов из группы без кариеса стаж астмы был более 1 года, остальные дети были с впервые установленной астмой.


Таблица 1. Характеристика обследуемых групп

tabl-3-2024_16.jpg


Обследование детей включало осмотр специалистами: педиатром, аллергологом-иммунологом, стоматологом и пульмонологом, стандартные лабораторные показатели, в том числе IgЕ. На момент забора материала пациенты не принимали антибиотики. Лечение детей обеих групп с бронхиальной астмой в период обострения включало будесонид, ипратропия бромид/фенотерол и цетиризин. Пациент с тяжелым обострением получал преднизолон и аминофиллин.

Диагностика кариеса зубов была основана на критериях ВОЗ. Состояние здоровья полости рта и наличие кариеса пациентов было оценено при стоматологическом осмотре. Индекс интенсивности кариеса зубов измеряли путем вычисления количества кариозных, отсутствующих и запломбированных зубов. Оценка индекса интенсивности кариеса зубов включала все кариозные поражения на окклюзионных, межпроксимальных, щечных и язычных гладких поверхностях. Критерием начального кариеса было наличие белого (матового) пятна на поверхности эмали. Случаи кариеса зубов были закодированы, как 1 = присутствие, 0 = отсутствие кариеса. Индекс гигиены (ИГ) = Ки/n, где Ки — сумма индексов очистки всех исследуемых зубов; n — количество зубов, участвующих в тестировании (n = 6). ИГ: 1,1–1,5 балла — хороший; 1,6–2,0 балла – удовлетворительный; 2,1–2,5 балла — неудовлетворительный; 2,6–3,4 балла — плохой; 3,5–5,0 балла — очень плохой.

Вычислены достоверные различия концентрации IgЕ у детей с астмой (табл. 2) в зависимости от наличия кариеса. Уровень IgE был достоверно выше в группе детей с кариесом в сравнении с показателем у детей без кариеса.


Таблица 2. Концентрация иммуноглобулина Е (IgE) в зависимости от состояния ротовой полости обследованных детей

tabl-3-2024_17.jpg

Примечание. *р < 0,05 по сравнению с детьми без кариеса.


Забор образцов десневого субстрата проводили с использованием индивидуальных стерильных кюреток утром, после пробуждения, через 12 ч после вечерней чистки зубов и последнего приема пищи у детей без кариеса — из мезобуккальных участков левого моляра (7.5), у детей с кариесом — из мезобуккальных участков наиболее пораженного молочного зуба. Материал помещали в стерильные пробирки Эппендорфа с 0,2 мл буферного раствора ДНК-Экспресс («Литех»), до выделения ДНК хранили при –20°C. Обработку и последующий анализ образцов проводили в Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН. Процедура включала извлечение ДНК, подготовку библиотеки ДНК, высокопроизводительное секвенирование и биоинформационный анализ. Библиотеки были секвенированы на платформе MiSeq (Illumina). Таксономическую классификацию последовательностей проводили с использованием эталонных баз данных RDP и NCBI.


Методы математической обработки

Сообщества микробиома десневой борозды проанализированы на уровне операционно-таксономических единиц (ОТЕ), микробное богатство десневой борозды оценивали по показателям глубины охвата (Good's coverage) и индекса разнообразия Chao1. Сравнение индексов разнообразия между группами проводили с использованием U–критерий Манна — Уитни.

Суммарное богатство бактериальных сообществ оценивали с помощью анализа кривых разрежения, график построен с использованием ресурса QIIME2. Бактериальные сообщества сравнивали с помощью метода главных компонент (PCoA) на основе расстояний Брея — Кертиса, двумерный график на уровне ОТЕ построен с помощью MicrobiomeAnalyst[19, 20]. Различия бактериальных сообществ оценивали на основании построения филогенетического дерева (UniFrac). Различия между таксонами проводили с помощью статистических методов Манна — Уитни и Краскала — Уоллиса.


РЕЗУЛЬТАТЫ

Полученные ОТЕ сгруппированы на уровне сходства 97%; микробное богатство десневой борозды (Good's coverage) и индекс разнообразия Chao1 были высокими, что указывает на достаточное разнообразие видов в группах. Сравнение индексов разнообразия не выявило статистически значимых различий между группами.


Таблица 3. Характеристика образцов

tabl-3-2024_18.jpg

Примечание. M — среднее; m — стандартная ошибка выборочного среднего; U-критерий Манна — Уитни показал отсутствие достоверных различий между группами по всем показателям.


Проведенная оценка суммарного богатства бактериальных сообществ для групп А и С показала, что глубина секвенирования была достаточной (рис. 1), учтено практически все разнообразие в исследуемых образцах (выход на плато).


Рис. 1. Кривые разрежения: а — для группы А (астма без кариеса); б — для группы С (кариес с астмой). По осям абсцисс — количество ридов, по осям ординат — количество операционных таксономических единиц

ris-3-2024_19.jpg


Метод главных компонент показал значительное перекрытие между образцами групп А и С (все образцы расположились в проекции малого круга, что свидетельствует об их сходности по составу ОТЕ, но при этом объединения образцов по кариесу не обнаружено (рис. 2). Два образца — С_11 и А_15 — расположились отдельно от других (эти образцы имели небольшое количество ОТЕ, но клинические данные детей существенно не различались).


Рис. 2. Двумерный график десневых сообществ.

Красным обозначены образцы группы А, голубым — группы С. Подпись включает идентификационный номер образца

ris-3-2024_20.jpg


Согласно полученным данным, на трехмерном графике микробных сообществ десневой борозды четких различий между сравниваемыми группами по составу и общему разнообразию бактериальных ОТЕ также не установлено (рис. 3).


Рис. 3. Трехмерный график микробных сообществ десневой борозды.

Красным обозначены образцы группы А, голубым — группы С

ris-3-2024_21.jpg


Анализ альфа-разнообразия не выявил существенных различий между образцами групп (рис. 4). При этом практически одинаковое количество образцов расположено в центре, что свидетельствует о том, что бо́льшая часть образцов имеет сходный состав, несмотря на отсутствие или наличие кариеса.


Рис. 4. Альфа-разнообразие микробных сообществ десневой борозды.

Красным обозначены образцы группы А, голубым — группы С

ris-3-2024_22.jpg


Филогенетическое дерево показало разделение бактериального сообщества на три основные ветви, в которые вошли образцы обеих групп (рис. 5).


Рис. 5. Распределение бактериальных сообществ по составу.

Красным обозначены образцы группы А, голубым — группы С

ris-3-2024_23.jpg


Оценка таксономии образцов десны установила 7 бактериальных типов, 12 классов бактерий, 18 порядков бактерий, 26 семейств бактерий. Большинство последовательностей в группах были отнесены к 5 бактериальным филумам (первые четыре выявлены у всех детей). В группе С выявлены Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria, Bacteroidetes, Fusobacteria (частота встречаемости филумов в образце более 1%, записано по убыванию). В группе А последовательность бактериальных филумов иная: Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Fusobacteria, достоверных различий на уровне филума межу группами А и С не установлено. Филумы Candidatus Saccharibacteria и SR1 встречались менее чем в 1% проанализированных ридов в образцах (рис. 6).


Рис. 6. Распределение бактериальных филумов.

а — группа А; б — группа С

ris-3-2024_24.jpg


Достоверные различия выявлены на уровне порядка — Burkhoideriles, семейства — Burkholderiaceae (достоверно преобладает у детей с астмой; p = 0,053), на уровне рода — Lautropia (p = 0,05), различия на уровне вида представлены на рис. 7.


Рис. 7. Численность видов бактерий в группах.

Голубые — группа C; красные — группа A. *p < 0,05 между таксонами

ris-3-2024_25.jpg


На уровне вида также в группе детей с астмой достоверно более значимо было превышение OUT для Neisseria oralis (p = 0,0073), Haemophilus massiliensis (p = 0,046), Haemophilus paraphrohaemolyticus (p = 0,05) и Lautropia mirabilis (p = 0,05).


ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований установлено, что у детей с бронхиальной астмой микробиом десневой борозды состоит из 5 основных филумов: Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Fusobacterium и Bacteroidetes. Доминирующим родом микробиома десневой борозды у детей с астмой является Streptococcus, что согласуется с предыдущими исследованием.

Определено, что представленность «основных» родов десневой борозды отличалась в зависимости от наличия кариеса. В топ-10 родов вошли 7 общих для 2 групп: Streptococcus, Veillonella, Rothia, Haemophilus, Neisseria, Actinomyces, Capnocytophaga. Состав «основного микробиома» детей со здоровой ротовой полостью отличался присутствием в нем родов Lautropia, Gemella, Corynebacterium, в то время как у пациентов с кариесом — Porphyromonas, Granulicatella и Prevotella.

Установлены достоверные различия между относительной распространенностью отдельных видов микробиома десневой борозды детей с астмой. Достоверное превышение относительной численности видов «здоровой» микробиоты десневой борозды детей с астмой и здоровой полостью рта, относящихся к филуму Proteobacteria (N. oralis, L. mirabilis), подтверждает ее защитные свойства, а достоверное преобладание условно-патогенной микробиоты (H. paraphrohaemolyticus, H. massiliensis) может являться признаком дисбиоза ротовой полости при астме.

Проведенное исследование показало, что полученная комбинация микробов может рассматриваться в качестве биомаркера (предиктора) астмы, что косвенно подтверждается достоверным увеличением уровня IgЕ в группе детей с астмой в сочетании с кариесом. Гиперпродукция IgЕ у детей, страдающих астмой и кариесом, возможно, связана с кариесогенной флорой, что требует дальнейшего изучения.



Поступила: 30.05.2023

Принята к публикации: 29.09.2023



________

1 Global Initiative for Asthma. Global Strategy for Asthma Management and Prevention, 2022. URL: https://ginasthma.org

17 апреля 11:35
ЛИТЕРАТУРА
  1. Xie G., Chain P.S., Lo C.C. еt al. Community and gene composition of a human dental plaque microbiota obtained by metagenomic sequencing. Mol. Oral Microbiol. 2010;25(6):391–405. DOI: 10.1111/j.2041-1014.2010.00587.x
  2. Huang Y.J., Boushey H.A. The microbiome in asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 2015;135(1):25–30. DOI: 10.1016/j.jaci.2014.11.011
  3. Wang J., Qi J., Zhao H. et al. Metagenomic sequencing reveals microbiota and its functional potential associated with periodontal disease. Sci. Rep. 2013;3:1843. DOI: 10.1038/srep01843
  4. Abusleme L., Dupuy A.K., Dutzan N. et al. The subgingival microbiome in health and periodontitis and its relationship with community biomass and inflammation. ISME J. 2013;7(5):1016–1025. DOI: 10.1038/ismej.2012.174
  5. Botelho M.P., Maciel S.M., Cerci Neto A. et al. Cariogenic microorganisms and oral conditions in asthmatic children. Caries Res. 2011;45(4):386–392. DOI: 10.1159/000330233
  6. Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 1999;284(5418):1318–1322. DOI: 10.1126/science.284.5418.1318
  7. Hilty M., Burke C., Pedro H. et al. Disordered microbial communities in asthmatic airways. PloS One. 2010;5(1):e8578. DOI: 10.1371/journal.pone.0008578
  8. Huang Y.J., Nariya S., Harris J.M. et al. The airway microbiome in patients with severe asthma: Associations with disease features and severity. J. Allergy Clin. Immunol. 2015;136(4):874–884. DOI: 10.1016/j.jaci.2015.05.044
  9. McCauley K., Durack J., Valladares R. et al. National Institute of Allergy and Infectious Diseases–sponsored Inner-City Asthma Consortium. Distinct nasal airway bacterial microbiotas differentially relate to exacerbation in pediatric patients with asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 2019;144(5):1187–1197. DOI: 10.1016/j.jaci.2019.05.035
  10. Teo S.M., Mok D., Pham K. et al. The infant nasopharyngeal microbiome impacts severity of lower respiratory infection and risk of asthma development. Cell Host Microbe. 2015;17(5):704–715. DOI: 10.1016/j.chom.2015.03.008
  11. Marsh, P. Contemporary perspective on plaque control. Br. Dent. J. 2012;212:601–606. DOI: 10.1038/sj.bdj.2012.524
  12. Chen T., Shi Y., Wang X. et al. High‑throughput sequencing analyses of oral microbial diversity in healthy people and patients with dental caries and periodontal disease. Mol. Med. Rep. 2017;16(1):127–132. DOI: 10.3892/mmr.2017.6593
  13. Bosshardt D.D., Lang N. P. The junctional epithelium: from health to disease. J. Dent. Res. 2005;84(1):9–20. DOI: 10.1177/154405910508400102
  14. Yamanaka W., Takeshita T., Shibata Y. et al. Compositional stability of a salivary bacterial population against supragingival microbiota shift following periodontal therapy. PloS One, 2012;7(8):e42806. DOI: 10.1371/journal.pone.0042806
  15. Di Cicco M., Pistello M., Jacinto T. et al. Does lung microbiome play a causal or casual role in asthma? Pediatric Pulmonol. 2018;53(10):1340–1345. DOI: 10.1002/ppul.24086
  16. Kim Y.H., Jang H., Kim S.Y. et al. Gram-negative microbiota is related to acute exacerbation in children with asthma. Clin. Transl. Allergy. 2021;11(8):e12069. DOI: 10.1002/clt2.12069
  17. Arrieta M.C., Stiemsma L.T., Dimitriu P.A. et al. Early infancy microbial and metabolic alterations affect risk of childhood asthma. Science Transl. Med. 2015;7(307):307ra152. DOI: 10.1126/scitranslmed.aab2271
  18. Cherkasov S.V., Popova L.Y., Vivtanenko T.V. et al. Oral microbiomes in children with asthma and dental caries. Oral Diseases. 2019;25(3):898–910. DOI: 10.1111/odi.13020
  19. Chong J., Liu P., Zhou G. et al. Using Microbiome Analyst for comprehensive statistical, functional, and meta-analysis of microbiome data. Nat. Protoc. 2020;15:799–821. DOI: 10.1038/s41596-019-0264-1
  20. Dhariwal A., Chong J., Habib S. et al. Microbiome Analyst: a web-based tool for comprehensive statistical, visual and meta-analysis of microbiome data, Nucleic Acids Res. 2017;45(W1):W180–W188. DOI: 10.1093/nar/gkx295

Похожие статьи

Новости

24 мая 16:32
Уберечь печень смолоду. Гепатит С и дети

Заседание инфекционной секции Общества детских врачей в г. Москве с участием автора журнала «Доктор.Ру» Мазанковой Людмилой Николаевны (д. м. н., профессора) пройдет 28 мая

24 мая 09:45
Дайджест статей к Всемирному дню осведомленности о шизофрении

Ежегодно 24 мая отмечается Всемирный день осведомленности о шизофрении. К этому дню мы подготовили дайджест статей, посвященных различным аспектам этого заболевания

23 мая 16:05
Междисциплинарные аспекты улучшения репродуктивных и перинатальных исходов, г. Ижевск

27 мая в Ижевске пройдет региональное собрание акушеров-гинекологов под руководством Сахабутдиновой Елены Петровны (к. м. н.), в котором примут участие несколько постоянных авторов журнала «Доктор.Ру»

21 мая 10:56
Кардиология на марше

4–6 июня состоится Ежегодная Всероссийская научно-практическая конференция «Кардиология на марше 2024» и 64-й сессия ФГБУ «НМИЦК им. ак. Е.И. Чазова» Минздрава России

21 мая 10:54
Акушерство и гинекология: новые реалии – новые возможности, г. Пермь

22 мая в Перми пройдет региональное собрание акушеров-гинекологов под руководством Падруля Михаила Михайловича (д. м. н., профессора), в котором примут участие несколько постоянных авторов журнала «Доктор.Ру»

Все новости
Партнеры